Оценка риска вертикального переноса аденоассоциированного вектора химерного серотипа PHP.eB в ооциты мышей

Abstract

Цель. Оценить риск вертикального переноса аденоассоциированного вирусного вектора химерного серотипа PHP.eB в половые клетки самок мышей на основе разработки оригинального способа получения ооцитов мышей, неконтаминированных соматическими клетками и свободными векторными частицами. Материалы и методы. Исследуемый вектор вводили внутривенно самкам аутбредных мышей CD-1 в дозе 5 × 1010 векторных геномов на мышь. Использовали оригинальную методологию, включающую гормональную суперовуляцию экспонированных животных, выделение ооцитов, их очистку от контаминирующих соматических клеток и прямую количественную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) на лизированных ооцитах. Содержание векторной ДНК в ткани головного мозга, яичников и в ооцитах оценивали на 1, 3, 7, 14, 30 и 90-е сут после введения вектора. Результаты. С использованием разработанного подхода исследована способность к вертикальному переносу в ооциты мышей аденоассоциированного вирусного вектора химерного серотипа PHP.eB. Установлено, что несмотря на персистенцию в ткани головного мозга и яичников до 3 мес, векторная ДНК не выявляется в ооцитах ни на одном из сроков после введения вектора. Заключение. Полученные данные демонстрируют отсутствие вертикального переноса в ооциты мышей исследуемой генной конструкции. Выявление аденоассоциированного вектора в яичниках при его необнаружении в ооцитах подтверждает эффективность разработанной методики получения ооцитов мышей, неконтаминированных соматическими клетками.Aim. To assess the risk of germline transmission of an adeno-associated virul vector of the chimeric serotype PHP.eB into the germ cells of female mice based on the development of an original method for obtaining mouse oocytes devoid of somatic cells and free vector particles. Materials and methods. The vector under study was administered intravenously to female outbred CD-1 mice at a dose of 5 × 10¹⁰ vector genomes/mouse using an original technique which included hormonal superovulation of exposed animals, oocyte isolation, their purification from contaminating somatic cells, and direct quantitative PCR on lysed oocytes. The vector DNA content in the brain tissue, ovaries, and oocytes was assessed on days 1, 3, 7, 14, 30, and 90 after vector administration. Results. Using the developed technique, we examined the ability of the adeno-associated virus vector of the chimeric serotype PHP.eB to undergo germline transmission into mouse oocytes. It was established that, despite persistence in brain and ovarian tissue for up to 3 months, vector DNA was not detected in oocytes at any time after vector administration. Conclusion. The obtained data demonstrate the absence of germline transmission of the studied genetic construct into mouse oocytes. The detection of the adeno-associated vector in the ovaries, despite its absence in oocytes, confirms the effectiveness of the developed technique for obtaining mouse oocytes uncontaminated with somatic cells.