Детекция точечных мутаций в гене DNMT3A при острых миелоидных лейкозах методом прямого автоматического секвенирования

Abstract

Цель исследования - определить частоту точечных мутаций гена DNMT3A при острых миелоидных лейкозах (ОМЛ) методом прямого автоматического секвенирования. Материал и методы. Исследовали пробы костного мозга и периферической крови 34 больных ОМЛ в возрасте от 21 до 64 лет, проходивших лечение в Свердловском областном онкогематологическом центре (г. Екатеринбург) в период с 2012 по 2014 г., из них с морфологическим вариантом ОМЛ М0 - 3 пациента, М1 - 1, М2 - 12, М3 - 3, М4 - 10, М5 - 2, М6 - 1, М7 - 1 пациент, бластная плазмацитоидная дендритоклеточная опухоль обнаружена у одного больного. Выделение тотальной РНК из лейкозных клеток проводили методом сорбции на силикагелевом носителе либо методом лизиса клеток с последующим связыванием РНК из раствора с мембраной (силикой) в миницентрифужной колонке с последующей обратной транскрипцией. Участки кДНК, соответствующие экзонам 18-26 гена DNMT3A, амплифицировали методом полимеразной цепной реакции. Детекцию мутаций гена DNMT3A проводили методом прямого автоматического секвенирования с использованием генетического анализатора ABI Prism 310. Результаты. Функционально значимые точечные мутации гена DNMT3A обнаруживались в 5,9% проб, во всех случаях - при ОМЛ, развившихся в исходе миелодиспластического синдрома, и были представлены несинонимичными нуклеотидными заменами. Частота детекции указанных мутаций при морфологических вариантах ОМЛ М2 и М4 без хромосомных аберраций и точечных мутаций гена ТР53 составляла 14,3%, что сопоставимо с данными многоцентровых международных исследований. Наряду с мутациями гена DNMT3A в указанных образцах определялись точечные мутации генов NPM1, KRAS, WT1. Во всех наблюдениях ОМЛ с мутациями гена DNMT3A ассоциировались с низкой эффективностью стандартной программной полихимиотерапии циторабином в сочетании с антрациклиновыми антибиотиками и неблагоприятным прогнозом.

Aim: to estimate the frequency of DNMT3A gene exons 18–26 point mutations in acute myeloid leukemia (AML) patients (pts) using target automatic sequencing technique. Material and Methods. Bone marrow and peripheral blood samples were obtained from 34 AML pts aged 21 to 64, who were treated in Sverdlovsk Regional Hematological Centre (Ekaterinburg) during the period 2012–2014. Distribution of the pts according to FAB-classification was as follows: AML M0 – 3, M1 – 1, M2 – 12, M3 – 3, M4 – 10, M5 – 2, M6 – 1, M7 – 1, blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm – 1. Total RNA was extracted from leukemic cells and subjected to reverse transcription. DNMT3A gene exons 18–26 were amplified by PCR. Detection of mutations in DNMT3A gene was performed by direct sequencing. Sequencing was realized using an automatic genetic analyzer ABI Prism 310. Results. The average frequency of functionally significant point mutations in DNMT3A gene exons 18–26 among the treated AML pts was 5.9%. They were detected in morphological subgroups M2 and M4 (according to WHO classification). The average frequency of DNMT3A gene exons 18–26 point mutations among the AML M2 and M4 pts without chromosomal aberrations and TP53 gene point mutations was 14.3%. In both cases there were samples in which DNMT3A gene mutations were accompanied by molecular lesions of NPM1, KRAS and WT1 genes. AML pts with DNMT3A gene exons 18–26 point mutations characterized by poor response to standard chemotherapeutic regimens and unfavorable prognosis.